Los fenoles del polen del género Zea

LOS FENOLES DEL POLEN DEL GÉNERO ZEA

Norma Almaraz-Abarca1,5, Diana María Rivera-Rodríguez1, David Arráez-Román2,3, Antonio Segura-Carretero2,3, José de Jesús Sánchez-González4, Amanda Delgado-Alvarado1, José Antonio Ávila-Reyes1

1Instituto Politécnico Nacional, Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional, Unidad Durango, Sigma 119, Fraccionamiento 20 de Noviembre II, 34220 Durango, Durango, México.

2Universidad de Granada, Facultad de Ciencias, Departamento de Química Analítica, Avenida Fuente nueva s/n, 18071 Granada, España.

3Centro de Investigación y Desarrollo del Alimento Funcional, Parque Tecnológico de Ciencias de la Salud, Avenida del Conocimiento 3, 18100 Granada, España.

4Universidad de Guadalajara, Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, km 15.5 Carretera a Nogales, 45101 Zapopan, Jalisco, México.

5Autor para la correspondencia: nalmaraz@ip.mx; noralab@yahoo.com

RESUMEN

Se analizó la variabilidad de la composición fenólica del polen de 32 poblaciones de Zea mays subsp. mexicana, Zea mays subsp. parviglumis, Zea mays subsp. mays, Zea diploperennis, Zea perennis y Zea luxurians de México y Guatemala. Los perfiles se obtuvieron por cromatografía líquida de alta presión con detector de arreglo de diodos (HPLC-DAD) y cromatografía líquida de ultra resolución acoplada a espectrómetro de masas de tiempo de vuelo (UPLC-TOF-MS). Se encontró un total de 23 compuestos fenólicos (cuatro ácidos fenólicos, 16 flavonoles y tres dihidroflavonoides). Los derivados glicósidos de quercetina (siete derivados, además de la quercetina aglicona misma) fueron las substancias predominantes en todos los analisis realizados. El compuesto principal, el más abundante y presente en la totalidad de las muestras, incluido el maíz, se identificó como quercetina-3,3’-O-diglucósido. El polen de todas las especies y subespecies de Zea analizadas mostraron patrones muy similares de fenoles acumulados; sin embargo, diferencias en los compuestos menores (ácidos fenólicos y dihidroflavonoides) permitieron discernir variaciones inter e intraespecíficas, aunque la división del género en las dos secciones Luxuriantes y Zea no fue claramente sustentada. La baja variación de los perfiles fenólicos del polen dentro del género Zea apoya la propuesta de que el maíz y algunos teocintles son grupos conespecíficos, e indica que la composición fenólica del polen fue altamente conservada en los diferentes taxa de Zea a lo largo del tiempo.

Palabras clave: ácidos fenólicos, flavonoides, género Zea, polen, teocintle.

ABSTRACT

The variability of the pollen phenol composition of 32 populations of Zea mays subsp. mexicana, Zea mays subsp. parviglumis, Zea mays subsp. mays, Zea diploperennis, Zea perennis, and Zea luxurians from Mexico and Guatemala were analyzed. The phenol profiles were assessed by HPLC-DAD, and UPLC-TOF-MS. A total of 23 phenolics (four phenolic acids, 16 flavonols, and three dihydroflavonoids) were found. Quercetin glycosides (seven derivatives besides the quercetin aglycone itself) were the predominant compounds in the pollen of all analyzed species and subspecies. The major compound in all the samples, including the pollen of maize, was identified as quercetin-3,3’-O-diglucoside. The pollen of all the species and subspecies of Zea examined showed very similar patterns of accumulated phenols; however, variation in the minor compounds (phenolic acids and dihydroflavonoids) allowed to discern some inter- and intraspecific variations, although the split of Zea in the sections Luxuriantes and Zea was not clearly supported. The low level of variability of the pollen phenol profiles throughout the genus Zea supports the proposal that maize and some teosintes are conspecific groups, and indicates that the pollen phenol composition is highly conserved in the different taxa of Zea.

Key words: flavonoids, genus Zea, phenolic acids, pollen, teosinte.

INTRODUCCIÓN

El género Zea es nativo de México (Sánchez et al., 2000). De acuerdo con Sánchez et al. (2011), el mismo está formado por ocho taxa agrupados en dos secciones, cinco especies y cuatro subespecies. La sección Luxuriantes Doebley & Iltis incluye a Zea perennis (Hitchc.) Reeves & Mangelsdorf, Zea diploperennis Iltis, Doebley & Guzmán, Zea luxurians (Durieu & Ascherson) Bird y Zea nicaraguensis Iltis & Benz). La sección Zea la forman Zea mays subsp. mexicana (Schrader) Iltis, Zea mays subsp. parviglumis Iltis & Doebley, Zea mays subsp. huehuetenangensis (Iltis & Doebley) Doebley y Zea mays subsp. mays.

El único componente cultivado del género, Zea mays subsp. mays, incluye todas las razas y variedades de maíz; todos los demás taxa son colectivamente llamados teocintles (Fig. 1). Dentro de Zea mays subsp. mexicana se reconocen cuatro razas: Chalco, Mesa Central, Durango y Nobogame. La raza Balsas es la única considerada dentro de Zea mays subsp. parviglumis (Doebley, 1990). Nuevas poblaciones de teocintles, que requieren ser ubicadas taxonómicamente, se siguen descubriendo en México y Centro América (Iltis y Benz, 2000; Sánchez et al., 2011).

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Fig. 1. Dos especies de teocintles, A: Zea mays subsp. parviglumis y B: Zea diploperennis, mostrando las inflorescencias masculinas.

Los teocintles han tenido una importante influencia en el origen y variabilidad del maíz en la República Mexicana (Wilkes, 2004), y contienen germoplasma valioso para el desarrollo de nuevas variedades de ese cereal, principalmente aquellas tolerantes a enfermedades y estrés ambiental (Nault y Findley, 1981; Cohen y Galinat, 1984). En algunas regiones del país son importantes como forraje, debido a su calidad nutricional, su potencial de producción y sus mecanismos de dispersión y establecimiento (Sánchez-González et al., 1998).

Los flavonoides y los ácidos fenólicos son compuestos sintetizados en prácticamente todos los tejidos de las plantas. El polen es una fuente importante de flavonoles glicósidos y de ácidos fenólicos (Wiermann y Vieth, 1983; Campos, 1997; Almaraz-Abarca et al., 2007). Los perfiles de esas dos clases de compuestos varían entre diferentes grupos de plantas con una tendencia de ser caracteristicos para cada especie (Campos et al., 1997; Fiasson et al., 1997; Campos et al., 2002; Almaraz-Abarca et al., 2004, 2006, 2008).

Los flavonoides y los ácidos fenólicos desempeñan importantes y diversas funciones en las plantas, tales como la protección de los tejidos vegetales contra el daño potencial de la radiación UV (Casati y Walbot, 2003) y contra herbívoros (Lee et al., 1998). Muchos de esos compuestos tienen valiosas propiedades biológicas con implicaciones médicas (Zhang y Cui, 2005).

Los esfuerzos enfocados en determinar la composición fenólica del polen de las especies de Zea han sido escasos, solamente algunos tipos de maíz (Zea mays subsp. mays) han sido estudiados en ese sentido. Redemann y sus colaboradores en 1950 (Larson y Lonergan, 1972) y más tarde Ceska y Styles (1984) determinaron la composición fenólica del polen de maíz y mencionaron la presencia de quercitrina. Ceska y Styles (1984) además reportaron otros ocho derivados glicósidos de quercetina e isoramnetina, sólo un derivado glicósido de canferol (canferol 3-O-glucósido), este último presente en trazas, y resaltaron la ausencia de flavonas en el polen de maíz. En el presente trabajo se determinó, por cromatografía líquida de alta presión, con detector de arreglo de diodos (HPLC-DAD) y cromatografía líquida de ultra presión acoplada a espectrometría de masas de tiempo de vuelo (UPLC-TOF-MS), la variabilidad de la composición de flavonoides y ácidos fenólicos del polen de Zea mays subsp. mexicana, Zea mays subs. parviglumis, Zea mays subsp. mays, Zea diploperennis, Zea perennis y Zea luxurians de México y Guatemala. Se presentan las implicaciones taxonómicas de la variación de los perfiles fenólicos y la importancia del polen de las especies de Zea como fuente de flavonoides.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

El material genético incluido en el presente estudio consistió de 32 poblaciones de Zea mays subsp. mexicana, Zea mays subsp. parviglumis, Zea mays subsp. mays, Zea diploperennis, Zea perennis y Zea luxurians de México y Guatemala. En el año 2011 se cultivaron diez plantas de cada población bajo condiciones de invernadero en el Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional, del Instituto Politécnico Nacional, Unidad Durango (CIIDIR IPN Durango), en Durango, México. Las semillas, excepto las de Zea mays subsp. mays (de una variedad criolla, proporcionadas por un productor de Durango, México), fueron donadas por el Banco de Germoplasma de la Universidad de Guadalajara, Jalisco. La información geográfica de todas las poblaciones estudiadas se presenta en el Cuadro 1.

Cuadro 1. Información geográfica de las especies, subespecies y poblaciones de Zea analizadas en el presente estudio, todas originarias de México, excepto Z. luxurians, que fue de Guatemala.

Especie

Localidad

Latitud (N)

Longitud (O)

Altitud (m)

Número de población

Año de colecta

Z. mays subsp. mexicana, raza Chalco

Chapultepec, Estado de México

19°12'12"

99°34' 3"

2602

615

2007

Z. mays subsp. mexicana, raza Chalco

km 1 Aljojuca-Santa María Coatepec, Aljojuca, Puebla

19°5'51"

97°33'6"

2437

623

2007

Z. mays subsp. mexicana, raza Chalco

San Antonio Zoyatzingo, Amecameca, Estado de México

19°4'54"

98°46'35"

2468

635

2007

Z. mays subsp. mexicana, raza Chalco

Miraflores-La Candelaria Tlapala, Chalco, Estado de México

19°13'57"

98°50'3"

2280

638

2007

Z. mays subsp. mexicana, raza Central Plateau

Cerro Churintzio, Churintzio, Michoacán

20°9'25"

102°3'35"

1949

426

2002

Z. mays subsp. mexicana, raza Central Plateau

Uriangato, Uriangato, Guanajuato

20°10'8"

101°9'22"

1880

447

2002

Z. mays subsp. mexicana, raza Central Plateau

San Agustín del Maíz, Copándaro, Michoacán

19°53'27"

101°10'46"

1855

450

2002

Z. mays subsp. mexicana, raza Central Plateau

Potrero El Tepalcate, Nombre de Dios, Durango

24°2'32"

104°16'47"

1870

705

2009

Z. mays subsp. mexicana, raza Central Plateau

Puente Gavilanes, Durango, Durango

24°1'12"

104°29'16"

1868

710

2009

Z. mays subsp. mexicana, raza Nobogame

Arroyo Tarahumares, Guadalupe y Calvo, Chihuahua

26°12'58"

106°56'33"

1928

607

2007

Z. mays subsp. parviglumis, raza Balsas

San Lorenzo, Ejutla, Jalisco

19°57'6"

103°59'3"

1000

201

2007

Z. mays subsp. parviglumis, raza Balsas

El Rodeo, Tolimán, Jalisco

19°33'0"

104°3'0"

1462

232

2007

Z. mays subsp. parviglumis, raza Balsas

Amatlán de Quetzalcoatl, Tepoztlán, Morelos

18°58'30"

99°1'49"

1654

474

2003

Z. mays subsp. parviglumis, raza Balsas

San Cristobal Honduras, Oaxaca

16°19'26"

97°1'57"

590

483

2003

Z. mays subsp. parviglumis, raza Balsas

Puerto de La Cruz, Carácuaro, Michoacán

18°57'47"

101°3'27"

870

517

2003

Z. mays subsp. parviglumis, raza Balsas

Los Cimientos, Villa Purificación, Jalisco

19°42'15"

104°49'8"

552

546

2003

Z. mays subsp. parviglumis, raza Balsas

Plan de los Timbres, Huitzuco de los Figueroa, Guerrero

18°15'9"

99°14'1"

1183

643

2007

Z. mays subsp. parviglumis, raza Balsas

Vista Hermosa, Olinalá, Guerrero

17°45'37"

98°46'28"

1580

646

2007

Z. mays subsp. parviglumis, raza Balsas

Camino Vista Hermosa-Colotlipa, Quechultenango, Guerrero

17°26'16"

99°12'5"

945

650

2007

Z. mays subsp. parviglumis, raza Balsas

El Rincón, Chilpancingo de los Bravo, Guerrero

17°17'13"

99°28'59"

740

654

2007

Z. mays subsp. parviglumis, raza Balsas

El Salado, Mochitlán, Guerrero

17°23'48"

99°26'12"

1150

657

2007

Z. mays subsp. parviglumis, raza Balsas

Zacatlancillo, Teloloapan, Guerrero

18°25'0"

99°58'3"

1746

661

2007

Z. mays subsp. parviglumis, raza Balsas

Ixcateopan, Guerrero

18°30'16"

99°47'4"

1891

666

2007

Z. mays subsp. parviglumis, raza Balsas

Oxtotitlán, Teloloapan, Guerrero

18°10'41"

99°56'00"

1098

669

2007

Z. mays subsp. parviglumis, raza Balsas

Huixtitla, Amatepec, Estado de México

18°38'26"

100°21'24"

1008

674

2007

Z. mays subsp. parviglumis, raza Balsas

km 109 Tejupilco-Altamirano, Michoacán

18°53'41"

100°12'32"

1357

679

2007

Z. mays subsp. parviglumis, raza Balsas

Quechendio, Huetamo, Michoacán

18°48'18"

100°56'46"

631

684

2007

Zea diploperennis

Las Joyas, Cuautitlán de García B., Jalisco

19°35'26"

104°16'41"

1870

551

2003

Zea diploperennis

San Andrés Milpillas, Huajicori, Nayarit

22°51'26"

105°6'57"

1400

692

2008

Zea luxurians

km 162 Agua Blanca-Ipala, Agua Blanca, Jutiapa

14°31'32"

89°39'45"

895

G3

2004

Zea perennis

Piedra Ancha, San Gabriel, Jalisco

19°38'7"

103°34'47"

2140

694

2008

Preparación de las muestras

Las muestras de polen se colectaron directamente de las anteras de 10 plantas adultas de cada una de las 32 poblaciones. El polen de las 10 plantas de una misma población se combinó y se analizó de manera independiente. El polen colectado se almacenó a -20 °C hasta su uso.

Reactivos químicos

El acetonitrilo (grado HPLC), agua (grado HPLC), etanol (grado HPLC) y acetato de etilo (grado analítico) se compraron a J. T. Baker (Xalostoc, México). El ácido acético, hidróxido de sodio, 2-propanol, quercetina, quercitrina (quercetin-3-ramnosido), canferol-3-glucósido, y ácido caféico se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo, USA). El canferol-3,7-O-diglucósido, quercetina-3-O-[ramnosil-(1-6) galactósido], canferol-3-O-[ramnosil (1-6) glucósido] se consiguieron en Apin Chemicals Limited (UK).

Preparación de extractos fenólicos

Los extractos fenólicos de polen se prepararon de acuerdo con la técnica de Markham y Campos (1996), combinando 100 mg de polen con 1 mL de una solución de etanol a 50% (v/v) y sonicando durante 60 min. Las mezclas resultantes se centrifugaron a 5000 rpm durante 10 min. Las alícuotas de los sobrenadantes se usaron para los análisis de HPLC-DAD y UPLC-TOF-MS.

Análisis de HPLC-DAD

Los perfiles de HPLC-DAD de flavonoides y ácidos fenólicos se determinaron de acuerdo al protocolo descrito por Campos y Markham (2007). Las alícuotas (100 µL) de cada muestra se analizaron en un equipo HPLC Perkin Elmer Series 200 HPLC y una columna Perkin Elmer Brownlee Validated C18 (4.6 x 250 mm, 5 µm). El solvente A fue agua acidificada (ajustada a pH 2.5 con ácido ortofosfórico) y el solvente B fue acetonitrilo, mezclados de acuerdo con el siguiente gradiente lineal: iniciando con 100% de A, disminuyendo a 91% a los 12 min, a 87% a los 20, a 67% a los 32 y a 57% a los 42 min, y manteniendo ese nivel hasta completar 60 min de análisis. La velocidad de flujo fue de 0.8 mL/min, a temperatura ambiente. Los cromatogramas se registraron a 260 y 340 nm. Los datos espectrales para todos los picos se registraron en el intervalo de 220 a 400 nm, usando un detector de arreglo de diodos (Perkin Elmer Series 200). La información estructural se obtuvo por comparación directa de los tiempos de retención y los espectros UV, de cada compuesto resuelto en los cromatogramas con los correspondientes a los compuestos de referencia, y por comparación de esos parámetros con la información compilada por Mabry et al. (1970) y Campos y Markham (2007).

Análisis de UPLC-TOF-MS

Estos análisis se realizaron en un sistema Waters Acquity UPLC (Waters, Millford, MA). Se usó una columna Zorbax Eclipse Plus C18 (1.8 μm, 150 × 4.6 mm) UPLC. La separación de los compuestos se realizó a 25 ºC, con un programa de elución en gradiente, y una velocidad de flujo de 0.8 mL/min. El volumen de inyección fue de 10 μL. La fase móvil consistió de agua y ácido acético (15%) como solvente A, y acetonitrilo como solvente B. Se aplicó el siguiente gradiente lineal: 0 min, 5% de B; 10 min, 30% de B; 12 min, 33% de B; 17 min, 38% de B; 20 min, 50% de B; 23 min, 95% de B; y 25 min, 5% de B. Las condiciones iniciales se mantuvieron durante 10 min más.

El sistema UPLC estuvo acoplado a un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo (micrOTOFTM, Bruker Daltonics GmbH, Bremen, Alemania), equipado con una interfase ESI modelo G1607A (Agilent Technologies), operando en modo ión negativo. En ese estado se requirió un “splitter” tipo T (split = 1:3) para el acoplamiento con el detector de masas cuando el flujo en el detector TOF fue de 0.2 mL/min para lograr resultados reproducibles y aspersión estable. Así, en el presente estudio el flujo que llegó al detector ESI-TOF-MS fue de 0.2 mL/min. Los valores óptimos de los parámetros de fuente fueron los siguientes: voltaje capilar, +4 kV; temperatura de secado de gas, 210 °C; flujo de gas, 8 L/min; presión de gas nebulizante, 2 bar; “end-plate offset”, -0.5 kV. Las condiciones de transferencia fueron: salida capilar, -120 V; “skimmer” 1, -40 V; hexapolo 1, - 23 V; RF hexapolo, 50 Vpp; “skimmer” 2, -22.5 V. Los parámetros de fuente y transferencia se optimizaron para asegurar buena sensibilidad, alcanzar una resolución razonable en el intervalo de masas de los compuestos blanco (50-1100 m/z) y mejorar el comportamiento de la ionización.

La calibración externa del espectrómetro de masas se llevó a cabo con una solución conteniendo hidróxido de sodio 5 mM en agua/2-propanol (1/1, v/v), con ácido acético a 0.2%, en modo de regresión cuadrática de calibración de alta precisión (HPC). Con este método se logró una curva de calibración exacta basada en diversos grupos (clusters) de masas, cada una difiriendo en 82 Da (C2H3NaO2). La solución de calibración se inyectó al inicio del análisis usando una bomba Cole Palmer (Vernon Hills, Illinois, USA) y todos los espectros se calibraron antes de la caracterización de fenoles. Los datos de masa exacta para los iones moleculares se procesaron con el programa Data Analysis 4.0 (Bruker Daltonics, Bremen, Alemania), el cual proporcionó una lista de fórmulas elementales posibles, usando el editor Generate Molecular FormulaTM. Ese editor se basa en un algoritmo CHNO que proporciona funcionalidades estándares tales como intervalo elemental mínimo/máximo, equivalentes anillo y doble enlace, y una comparación sofisticada de patrón teórico y medido de isótopos (valor mSigma) para incrementar la confianza en la fórmula molecular sugerida. De acuerdo con la literatura, el nivel aceptado de umbral de exactitud para confirmar la composición elemental se estableció en 5 ppm para la mayoría de los compuestos (Gross, 2010).

Análisis de datos

Los perfiles fenólicos individuales se construyeron con todos los compuestos presentes en los cromatogramas HPLC-DAD y UPLC-TOF-MS; cada uno se consideró como un carácter químico individual y con ellos se construyó una matriz binaria de presencia (1)-ausencia (0). Se generó una matriz de distancias entre poblaciones, basada en el coeficiente de disimilitud de Jaccard, y un análisis de agrupamiento, usando el método de incremento en la suma de cuadrados (Clustan Graphics 8). El número óptimo de grupos (clusters) se estimó usando el procedimiento de validación de árbol, por medio de permutación aleatoria de datos originales, que compara un árbol obtenido por un juego de datos con la familia de árboles generados por permutación aleatoria del mismo juego de datos (Wishart, 2006).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Composición fenólica del polen

Un total de 23 compuestos se resolvieron por los análisis de HPLC-DAD y UPLC-TOF-MS, de acuerdo con sus tiempos de retención (TR), las características de sus espectros UV, los datos de sus espectros de masas, y los datos proporcionados por las compilaciones de Mabry et al. (1970) y Campos y Markham (2007). En el Cuadro 2 se muestran los TR1 y datos espectrales UV del análisis de HPLC-DAD, y en el Cuadro 3 los TR2 y datos de los espectros de masas obtenidos del análisis de UPLC-TOF-MS.

Las estructuras propuestas de los compuestos resueltos por UPLC-TOF-MS se muestran en las Figs. 2 y 3. El análisis reveló cuatro ácidos fenólicos, saflomina A (9) (Iswaldi et al., 2011), ácido ferúlico (14) (Gardana et al., 2007), y dos compuestos no identificados (22 y 23); 16 flavonoles, determinados como quercetina-3,7-O-diglucósido (1) (Vallejo at al., 2004), quercetina-3-O-arabinosilglucósido (2), quercetina-3-soforósido-7-glucósido (3) (Rochfort et al., 2006), quercetina-3,3’-O-diglucósido (4) (Morikawa et al., 2009), isoramnetina-3-O-gentobiósido (5) (Dahia et al., 2009), un flavonol glicósido no identificado (6), quercetina-3-O-ramnoglucósido (7), canferol-3-O-β-ramnoglucósido (8), isoramnetina-3-O-β-ramnoglucósido (10), 6-metoxiquercetina (11) (Zhang et al., 2007), quercetina-3-O-galactósido (12) (Hiroaka et al., 1987), quercetina-3-α-L-arabinofuranósido (13) (Schieber et al., 2003), quercetina-ramnósido (15) (Ferracane et al., 2010), isoramnetina-3-O-D-glucósido (16) (Dahia et al., 2009), un flavonol glicósido no identificado (17), y quercetina (18) (Tao et al., 2011); y tres dihidroflavonoides, naringenina (19) (Tao et al., 2011), y dos no determinados (20 y 21). Entre los flavonoles, los derivados glicósidos de quercetina fueron los compuestos fenólicos más comunes y abundantes en el polen de todas las especies y subespecies analizadas de Zea. El compuesto principal (el encontrado a mayor concentración) en todas las muestras fue 4 (quercetina-3,3’-O-diglucósido). El único derivado de canferol (8) (canferol-3-O-β-ramnoglucósido) se encontró en 25 de las 32 muestras de polen (201, 232, 426, 447, 474, 450, 483, 517, 623, 635, 638, 646, 650, 654, 657, 661, 666, 669, 679, 684, 694, 705, 710, G3, y maíz). Estos resultados están parcialmente de acuerdo con los de Ceska y Styles (1984), quienes reportaron a la quercetina-3,3’-O-diglucósido como el flavonoide principal en el polen de maíz, pero esos autores mencionaron que el canferol-3-O-glucósido (fórmula: C21H20O11, peso molecular: 448.38, λmax: 266, 297sh, 349) (Sakakibara et al., 2003; hoja de información técnica de Sigma Aldrich para ese compuesto) como el único derivado de canferol en el polen de esa especie, y de acuerdo con nuestros resultados, el único derivado de canferol encontrado fue el canferol-3-O-β-ramnoglucósido (8, fórmula: C27H29O15, m/z: 593.15, λmax: 266, 300sh, 350, Cuadros 2 y 3, Fig. 2).

Cuadro 2. Descripción de los compuestos fenólicos encontrados por el análisis de HPLC-DAD en los extractos de polen de 32 poblaciones de Zea.

Número de compuesto

TR1 (X±SD)

λmax (nm)

Tipo de compuesto

Presencia

1

27.800±0.273

256, 268sh, 355

Flavonol glicósido

Todos los taxa

2

28.176±0.250

255, 268sh, 354

Flavonol glicósido

Subsp. parviglumis, subsp. mexicana, Z. luxurians, maíz

3

31.465±0.250

250sh, 266, 345

Flavonol glicósido

Todos los taxa

4

33.353±0.200

253sh, 267, 345

Flavonol glicósido

Todos los taxa

5

34.142±0.170

253, 266, 346

Flavonol glicósido

Todos los taxa

6

34.412±0.171

254, 267, 349

Flavonol glicósido

Algunas poblaciones de subsp. parviglumis y subsp. mexicana

7

35.259±0.174

255, 266sh, 296sh, 354

Flavonol glicósido

Todos los taxa

8

37.102±0.102

266, 300sh, 350

Flavonol glicósido

Z. luxurians, maíz, algunas poblaciones de subsp. mexicana y subsp. parviglumis

9

36.025±0.000

243sh, 268sh, 290sh, 322

Ácido fenólico

Z. perennis

10

37.246±0.125

254, 269sh, 298sh, 354

Flavonol glicósido

Todos los taxa

11

37.369±0.083

254, 268sh, 295sh, 354

Flavonol glicósido

Z. diploperennis

12

37.876±0.195

255, 266sh, 297sh, 355

Flavonol glicósido

Todos los taxa

13

38.756±0.000

254, 269sh, 294sh, 355

Flavonol glicósido

Z. diploperennis

14

39.34±0.000

243sh, 268sh, 293sh, 325

Ácido fenólico

Z. perennis

15

40.19±0.000

254, 264sh, 293sh, 348

Flavonol glicósido

Z. diploperennis y Z. luxurians

16

40.704±0.000

255, 267sh, 296sh, 355

Flavonol glicósido

Z. perennis, una población de subsp. parviglumis

17

45.356±0.274

255sh, 272, 340

Flavonol glicósido

Algunas poblaciones de subsp. parviglumis, subsp. mexicana, Z. diploperennis

18

48.785±0.000

255, 270sh, 300sh, 372

Flavonol

Z. diploperennis

Z. perennis

19

54.558±0.273

288, 330sh

Dihidroflavonoide

Z. diploperennis

20

56.082±0.022

286, 353sh

Dihidroflavonoide

Una población de subsp. parviglumis

21

56.621±0.103

287, 338sh

Dihidroflavonoide

Algunas poblaciones de subsp. parviglumis, algunas poblaciones de subsp. mexicana, Z. luxurians

22

56.818±0.106

249sh, 296sh, 328

Ácido fenólico

Algunas poblaciones de subsp. parviglumis, algunas poblaciones de subsp. mexicana

23

61.436±0.173

246sh, 295sh, 327

Ácido fenólico

Algunas poblaciones de subsp. parviglumis, algunas poblaciones de subsp. mexicana

Cuadro 3. Descripción de los compuestos fenólicos encontrados por el análisis de UPLC-TOF-MS en los extractos del polen de 32 poblaciones de Zea.

Número de compuesto

TR2 (X±SD)

m/z experimental

m/z calculada

Fórmula

Error (ppm)

Valor mSigma

Compuesto propuesto

1

6.042±0.083

625.1413

625.1410

C27H29O17

-1.7

3.7

Quercetina-3,7-O-diglucósido

2

6.179±0.084

595.1312

595.1305

C26H27O16

-2.0

2.6

Quercetina-3-O-arabinosil-glucósido

3

7.122±0.078

787.1929

787.1939

C33H39O22

1.2

8.8

Quercetina-3-soforósido-7-glucósido

4

7.873±0.076

625.1418

625.1410

C27H29O17

-2.2

3.2

Quercetina-3,3’-O-diglucósido

5

8.173±0.065

639.1579

639.1567

C28H31O17

-1.8

0.6

Isoramnetina-3-O-gentobiósido

7

8.553±0.156

609.1468

609.1461

C27H29O16

-2.8

3.4

Quercetina-3-O-ramnoglucósido

8

9.293±0.060

593.1509

593.1511

C27H29O15

0.2

13.5

Canferol-3-O-β-ramnoglucósido

9

9.801±0.039

611.1594

611.1618

C27H31O16

3.9

32.0

Saflomina A

10

9.376±0.063

623.1624

623.1618

C28H31O16

-1.0

6.1

Isoramnetina-3-O-β-ramnoglucósido

11

9.611±0.000

331.0466

331.0459

C16H11O8

0.3

2.8

6-metoxiquercetina

12

9.617±0.102

463.0886

463.0882

C21H19O12

-0.6

3.4

Quercetina-3-O-galactósido

13

10.089±0.072

433.0768

433.0776

C20H17O11

4.0

8.9

Quercetina-3-α-L-arabinofuranósido

14

10.273±0.077

193.0511

193.0506

C10H9O4

-2.6

8.3

Ácido ferúlico

15

10.537±0.461

447.0920

447.0932

C21H19O11

2.7

22.5

Quercetina-ramnósido

16

10.669±0.053

477.1036

477.1038

C22H21O12

3.2

3.5

Isoramnetina-3-O-D-glucósido

18

14.499±0.033

301.0367

301.0353

C15H9O7

-0.8

0.9

Quercetina

19

17.307±0.127

271.0609

271.0612

C15H11O5

1.2

6.3

Naringenina

29459.jpg

Fig. 2. Estructura de los compuestos 1 a 5 y 7 a 11 encontrados en el polen de Zea.

29468.jpg

Fig. 3. Estructura de los compuestos 12 a 16, y 18 a 19 encontrados en el polen de Zea.

Recientemente, Chantarudee et al. (2012) reportaron la presencia de hidroquinona y 7-O-R-apigenina en las microsporas de maíz. En nuestro estudio, esos dos compuestos no fueron encontrados en el polen de ninguna de las especies ni subespecies de Zea analizadas. Nuestros resultados están de acuerdo con los de Ceska y Styles (1984), quienes resaltaron la ausencia de flavonas en el polen de Zea mays. Sin embargo, otras clases de fenoles, previamente no reportadas para tales microsporas, como ácidos fenólicos (9, 22, y 23) y dihidroflavonoides (19, 20, y 21) se detectaron en el presente estudio como compuestos menores en algunos de los parientes silvestres del maíz (Cuadros 2 y 3). La presencia de dihidroflavonoides fue previamente reportada en el polen de pinos (Strohl y Seikel, 1965).

Contrariamente a lo reportado por Ceska y Styles (1984), quienes mencionaron cuatro isoramnetinas glucósidos en el polen de maíz, y en contraste con Pollak et al. (1995), quienes no detectaron isoramnetina en el polen de ese mismo cereal, nosotros encontramos tres glicósidos de isoramnetina, la isoramnetina-3-O-gentobiósido (5) en todos los taxa de Zea, isoramnetina-3-O-β-ramnoglucósido (10) también en todos los taxa del género, e isoramnetina-3-O-D-glucósido (16) solamente en el polen de Z. perennis de Jalisco (694) y una población de Z. mays subsp. parviglumis (694).

Los flavonol-3-O-diglicósidos son los flavonoides más comúnmente acumulados en el polen, mientras que las agliconas se encuentran menos frecuentemente (Campos et al., 2002). Entre los pocos reportes que mencionan la presencia de flavonoides aglicona en el polen están el de Campos et al. (1997) en Eucalyptus globulus, y el de Campos et al. (2002) en Myrtaceae, subfamilia Leptospermoideae. Pollak et al. (1995) y previamente Larson y Lonergan (1972) registraron la acumulación de flavonoles agliconas además de flavonoles glicósidos en el polen de maíz. Sin embargo, con excepción de la quercetina aglicona (18), únicamente en el polen de Zea diploperennis de Nayarit (692), nosotros no encontramos flavonoles agliconas en los perfiles fenólicos del polen de Zea. Los flavonoides llevan a cabo diversas e importantes funciones en las plantas (Winkel-Shirley, 2001). Aunque no universalmente requeridos para la fertilidad del polen (Burbulis et al., 1996), en varias especies, incluyendo Zea mays, los flavonoles están involucrados en su germinación (Mo et al., 1992; Pollak et al., 1995). Esa función ha sido asociada a la quercetina, el canferol y a la miricetina (Ylstra et al., 1992; Vogt et al., 1995), pero particularmente en maíz se ha reportado la participación de la quercetina (Pollak et al., 1995). La predominancia de glicósidos de quercetina en el polen de todas las especies y subespecies de Zea analizadas en el presente estudio (Fig. 4) sugiere que, como en el maíz, la quercetina puede desempeñar una función similar en la germinación del polen y crecimiento del tubo polínico en las diferentes especies de teocintle.

Los perfiles fenólicos del polen de los diferentes taxa de Zea analizados fueron relativamente complejos (desde nueve compuestos en Zea mays susp. mays, a 14 en Zea mays subsp. mexicana raza Mesa Central de Michoacán, muestra 426, y de Durango, muestras 705 y 710), comparados con el número de compuestos encontrados en el polen de otras especies, como Agave durangensis (Agavaceae), que varió entre seis y siete, todos los compuestos siendo derivados glicósidos de canferol (Almaraz-Abarca et al., 2009); cinco especies de Myrtaceae, que variaron de dos a cuatro flavonas agliconas (Campos et al., 2002); Bidens odorata (Compositae), que fue de tres, dos canferol glicósidos y un ácido cinámico (Almaraz-Abarca et al., 2004); y Salix atrocinerea, que fue de dos, el canferol-3-O-neo-hesperidósido y un derivado de ácido caféico (Campos, 1997). Sin embargo, también se han reportado perfiles fenólicos de polen más complejos que los encontrados para el polen de las especies y subespecies de Zea, como el de Stenocactus multicostatus subsp. zacatecasensis (Cactaceae), formado por 14 a 19 compuestos, y el de Echinocereus pectinatus (Cactaceae), compuesto por 12 a 17 (Almaraz-Abarca et al., 2007).

Pocos compuestos, todos ellos menores, se encontraron de manera exclusiva en alguno de los taxa de Zea analizados. La saflomina A (9) y el ácido ferúlico (14) fueron privativos del polen de Z. perennis de Jalisco (muestra 694). La quercetina-3-α-L-arabinofuranósido (13) estuvo presente solamente en Z. diploperennis (muestras 551 y 692). La quercetina aglicona (18) fue peculiar del polen de Z. diploperennis de Nayarit (muestra 692), y el compuesto 20, un dihidroflavonoide, se detectó únicamente en el de Z. mays subsp. parviglumis del sur de Guerrero (muestra 654). Aparte de esas diferencias, las microsporas de las especies y subespecies de Zea analizadas mostraron patrones muy similares de fenoles principales (Fig. 4). Los seis primordiales compuestos (1, 3, 4, 5, 7 y 12) tuvieron la misma tendencia de acumulación en todas las muestras de polen de Zea analizadas (Fig. 4). El perfil formado por esos seis fenoles se podría considerar como un marcador químico para el género.

De acuerdo con Rice-Evans (1999), la estructura O-dihidroxi en el anillo B, el anillo C insaturado, y la estructura 5,7-dihidroxi en el anillo A de la quercetina confieren un alto potencial antioxidante, mientras que el anillo B, con un solo grupo 4’-hidroxil del canferol y la isoramnetina les da a esos compuestos menores niveles de tal propiedad. La predominancia de glicósidos de quercetina sobre los de canferol e isoramnetina en el polen de los teocintles sugiere que tales microsporas representan una fuente importante de antioxidantes naturales, que pueden encontrarse formando parte de las mezclas polínicas de origen apícola, como ha sido corroborado por Almaraz-Abarca et al. (2004).

29497.jpg

Fig. 4. Cromatogramas de HPLC de los polen de A: Zea mays subsp. parviglumis (muestra 201), B: Z. mays subsp. mexicana raza Mesa Central (muestra 426), C: Z. mays subsp. mexicana raza Nobogame (muestra 607), D: Z. mays subsp. mexicana raza Chalco (muestra 615), E: Z. diploperennis (muestra 551), F: Z. perennis (muestra 694), G: Z. luxurians (muestra G3). Los números de los picos corresponden al del compuesto como aparece en el Cuadro 2.

Variación interspecífica e intraspecífica

Los flavonoides son los principales marcadores quimiotaxonómicos (Markham, 1982; Campos et al., 2002; Almaraz-Abarca et al., 2004), pero los ácidos fenólicos también poseen cierto valor como indicadores químicos (Van Sumere, 1989), y pueden ser acumulados de manera ubicua a niveles importantes en los tejidos vegetales (Tamagnone et al., 1998). El polen de algunas especies de plantas es particularmente rico en ácidos fenólicos (Campos, 1997; Almaraz-Abarca et al., 2004, 2007), pero éstos pueden estar completamente ausentes en las microsporas de otras (Almaraz-Abarca et al., 2009). Con base en los perfiles completos de los fenoles del polen, incluyendo los tres ácidos fenólicos encontrados, los resultados del presente estudio permitieron discernir algunas variaciones inter e intraespecíficas en Zea (Fig. 5).

29505.jpg

Fig. 5. Agrupamiento de los taxa de Zea enlistados en el Cuadro 1, con base en el método de Ward (B = Raza Balsas, H = Raza Chalco, C = Raza Mesa Central, L = Z. luxurians, D = Z. diploperennis, P = Z. perennis).

El hecho de que todas las muestras del presente estudio fueron colectadas de plantas que crecieron bajo las mismas condiciones ambientales permite inferir que las diferencias encontradas en los perfiles fenólicos son el resultado de variaciones genéticas que dirigen un orden secuencial definido en la ruta de la biosíntesis. Esto es, de acuerdo con Heller y Forkmann (1994), propio y peculiar para cada especie de planta, y muchos de los pasos individuales de las modificaciones de los flavonoides están controlados por genes individuales (Forkmann, 1994).

El procedimiento de validación de árbol del método Clustan Graphics (Wishart, 2006), basado en 5000 pruebas aleatorias, encontró el número óptimo de grupos (clusters) y dividió a las muestras de teocintle en tres grupos. Este análisis, basado en una matriz binaria, reveló que los perfiles fenólicos del polen, difiriendo principalmente en compuestos menores, acomodan a Z. perennis y Z. diploperennis en uno de los tres conjuntos (Fig. 5). Estos resultados apoyan parcialmente la actual división del género Zea aceptada por varios autores (Doebley y Iltis, 1980; Iltis y Doebley, 1980; Doebley, 1990; Iltis y Benz, 2000; Sánchez et al., 2011). Sin embargo, la separación de las secciones Luxuriantes y Zea propuesta por Doebly e Iltis (1980) no fue claramente encontrada, ya que Z. luxurians (G3) se situó fuera del grupo de Z. perennis y Z. diploperennis (Fig. 5), las otras dos especies de la sección Luxuriantes. El perfil fenólico del polen de Z. luxurians estuvo más cercanamente relacionado con los de Z. mays subsp. parviglumis y de maíz, que con cualquiera de las otras dos especies de Zea de la sección Luxuriantes. Una relación más cercana entre Z. luxurians y Z. mays subsp. parviglumis que entre Z. luxurians y Z. perennis o Z. diploperennis fue también encontrada por Tiffin y Gaut (2001), con base en la variabilidad de secuencia de cuatro loci nucleares. Zimmer et al. (1988), Purugganan y Wesler (1994), Buckler y Holtsford (1996), y Tiffin y Gaut (2001), basándose en varias clases de datos moleculares, opinaron que la sección Luxuriantes no es un grupo natural. Nuestros resultados representan evidencia química que apoya la propuesta de esos autores.

Tiffin y Gaut (2001) reportaron que Zea perennis es un autotetraploide derivado de Z. diploperennis. Nuestros datos químicos revelaron una relación cercana entre las dos muestras de teocintles perennes diploides (población 551 y población 692), y entre éstas y la especie perenne tetraploide (población 694), las tres formando un solo grupo (Fig. 5), lo cual da evidencia para apoyar el dictamen de Tiffin y Gaut (2001). Sin embargo, la baja variabilidad encontrada en los perfiles fenólicos del polen no permite inferir acerca del origen autotetraploide de Z. perennis a partir de Z. diploperennis.

La cercana relación entre Zea mays subsp. mays con Z. mays subsp. parviglumis y Z. mays subsp. mexicana propuesta por algunos autores (Doebley et al., 1987) es sustentada por la similitud de sus patrones fenólicos polínicos. En dos de los tres grupos formados por el análisis de cluster (Fig. 5), poblaciones de la subsp. mexicana y la subsp. parviglumis se mezclan unas con otras, y algunas de las dos subespecies tienen perfiles fenólicos del polen muy similares, como la 474 de la subsp. parviglumis y la 447 de la subsp. mexicana; la 201 de la subsp. parviglumis y la 705 de la subsp. mexicana; y las 643 y 661 de la subsp. parviglumis y las 710 y 635 de la subsp. mexicana (Fig. 5). De manera similar a los resultados basados en el análisis de restricción de cpDNA (Doebley et al., 1987), los perfiles fenólicos del polen no discriminan entre Z. mays subsp. mexicana y Z. mays subsp. parviglumis (Fig. 5), diferenciación que sí ha podido realizarse usando datos de isozimas, morfológicos (Doebley, 1983; Goodman y Stuber, 1983; Doebley et al., 1984), y moleculares de genoma nuclear (Fukunga et al., 2005). Nuestros resultados sugieren que en el género Zea la tasa de evolución de los patrones fenólicos del polen ha estado desacoplada de la evolución de caracteres moleculares nucleares, bioquímicos y morfológicos. Un desacoplamiento similar de la evolución de caracteres ha sido reportada para el género Plagiomnium de musgos (Harris, 2009). Esa incongruencia entre diferentes clases de atributos ha sido explicada como una evolución asincrónica de marcadores (Hörandl, 2010).

La hibridación y la introgresión son eventos frecuentemente encontrados en muchas poblaciones naturales de plantas (Harborne y Turner, 1984), y su importancia en promover cambios evolutivos es tal que varios autores han estimado que alrededor de 70% de todas las especies de angiospermas se han originado por hibridación (Arnold, 1994; Whitham et al., 1999). La hibridación origina variación cualitativa y cuantitativa en los patrones de metabolitos secundarios (Orians et al., 2000), generando más variabilidad en las generaciones de híbridos posteriores a F1 (Rieseberg y Ellstrand, 1993). La baja diversidad encontrada en los perfiles fenólicos del polen de las especies y subespecies analizadas de Zea apoya lo reportado por Ross-Ibarra et al. (2009) acerca de que la hibridación y la introgresión, que de haber ocurrido entre varios taxa de Zea, no han sido eventos comunes. Los patrones actuales de distribución geográfica, en los que muchas poblaciones no se encuentran en forma simpátrica (Sánchez et al., 2011), sustenta también la afirmación de Ross-Ibarra et al. (2009).

La baja variabilidad encontrada en el presente trabajo en los patrones fenólicos del polen de Zea sugiere que esos perfiles han estado muy conservados durante el surgimiento de las diferentes especies del género, lo cual ocurrió casi de manera contemporánea hace 100,000 a 300,000 años (Gaut y Clegg, 1993; Ross-Ibarra et al., 2009), lo que podría estar asociado al importante papel que los flavonoides llevan a cabo en el funcionamiento normal del polen (Coe et al., 1981), como ha sido corroborado en maíz (Pollak et al., 1995).

Nuestros resultados se suman a la propuesta de algunos autores (Doebley et al., 1984; Doebley et al., 1987) de considerar al maíz y algunos teocintles como grupos conespecíficos, los cuales comparten procesos celulares esenciales del desarrollo (Dermastia et al., 2009) pues también comparten procesos cruciales de la síntesis y acumulación de fenoles en las estructuras reproductivas masculinas, como lo revela la semejanza encontrada de los perfiles fenólicos.

El perfil fenólico del polen de maíz y el de algunas poblaciones de Zea mays subsp. parviglumis, particularmente la 232 de Jalisco, son muy similares (Fig. 5). Esa semejanza brinda evidencia química que apoya la propuesta de Doebley et al. (1987) de que esa subespecie fue la progenitora del maíz.

CONCLUSIONES

El polen de Zea mays subsp. mexicana, Z. mays subsp. parviglumis, Z. mays subsp. mays, Z.diploperennis, Z. perennis, y Z. luxurians tienen patrones similares de acumulación de compuestos fenólicos, principalmente derivados glicósidos de quercetina, lo que lo hace una fuente importante de flavonoides antioxidantes. Los perfiles fenólicos de las especies y subespecies de Zea son muy semejantes, lo que es una evidencia química que apoya los hallazgos que han hecho diversos autores de que el maíz y algunos teocintles son grupos conespecíficos. La separación, con base en los perfiles fenólicos del polen, de Z. luxurians del grupo de Z. perennis y Z. diploperennis sustentan la propuesta de que la sección Luxuriantes no es un grupo natural.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a la Comisión de Operación y Fomento a las Actividades Académicas (COFAA) por los estímulos a la investigación, al Instituto Politécnico Nacional por el financiamiento de la investigación a través del proyecto SIP 20110499, y a Patricia García Salas y Celia Rodríguez del Centro de Investigación y Desarrollo del Alimento Funcional de Granada, España por su ayuda en los análisis de UPLC.

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Recibido en enero de 2013.

Aceptado en junio de 2013.

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